Флуоресцентные «маяки» помогут выявить слабые места в грибковых клетках

Ученые предложили метод, позволяющий быстро оценить, как дрожжевые клетки реагируют на противогрибковые соединения. Исследователи использовали группу штаммов пекарских дрожжей, в которых 64 белка, участвующие в ключевых метаболических путях, были слиты с зеленым флуоресцентным белком GFP. Благодаря этому авторам удалось за короткое время получить данные о ряде новых противогрибковых соединений.

При этом наибольшую опасность представляют штаммы патогенных грибов, устойчивые к существующим препаратам. Число известных противогрибковых средств весьма ограничено – существует всего несколько классов таких препаратов, причем к ряду из них грибы – например, некоторые виды Candida, поражающие слизистые оболочки, – стали устойчивыми и поэтому гораздо хуже поддаются лечению.

Чтобы решить эту проблему, ученые ищут уязвимости в клетках грибов, на которые можно воздействовать новыми лекарствами. Однако классические методы выявления таких мишеней (протеомный анализ, скрининг мутантных библиотек) требуют много времени и дорогостоящего оборудования. Исследователи Федерального исследовательского центра «Основы биотехнологии» РАН (Москва) и коллеги предложили простой и быстрый метод выявления уязвимостей в клетках грибов.

В эксперименте авторы использовали пекарские дрожжи — удобный модельный организм, клетки которого быстро делятся и легко растут.

Сначала, используя базы данных белков, исследователи определили 64 белка, которые выполняют важнейшие функции в дрожжевых клетках: они отвечают за синтез аминокислот (строительных блоков всех белков), защиту от окислительного стресса, выкачивание токсичных веществ из клетки, энергетический обмен и деление клеток. Из целой коллекции штаммов дрожжей авторы выбрали 64 варианта дрожжей, каждый из которых содержит один из выбранных белков, помеченный флуоресцентным «маяком» — пришитым к нему зеленым флуоресцентным белком GFP. При облучении синим лазером этот белок светится в зеленом спектре. Далее авторы обработали клетки двенадцатью различными препаратами, включая известные противогрибковые препараты и новые, малоизученные вещества. С помощью устройства, анализирующего свечение клеток, исследователи оценили, как менялась интенсивность флуоресцентных «маяков» в зависимости от используемого препарата. Свечение изменилось потому, что клетка в ответ на токсичное вещество (противогрибковый препарат) меняет уровень выработки определенных белков, и эти изменения отражают характер действия препарата.

Такой подход позволил избежать трудоемкого протеомного анализа, требующего много времени и дорогостоящего оборудования. За короткое время ученые проанализировали клеточную реакцию на 12 различных веществ и углубили понимание механизма их действия. Например, эксперимент позволил описать ранее неизвестный механизм действия алкилцитинидов — нового класса соединений с противогрибковой активностью, эффективность которых также показана в отношении грибов, поражающих предметы искусства и картины. Оказалось, что в результате воздействия алкилцитинидов активируется биосинтез ароматических аминокислот, а это тесно связано с системами антиоксидантной защиты клетки. Это открывает возможность разработки препаратов, которые будут избирательно влиять на этот процесс и эффективно бороться с клетками патогенных грибов. Особый интерес представляет то, что этот путь присутствует у грибов, растений и бактерий, но отсутствует у человека и животных. Таким образом, препараты, нацеленные на него, будут избирательно действовать на грибы и не влиять на клетки человека.

"Наш подход позволяет оценить клеточный ответ на противогрибковое соединение без трудоемкого протеомного анализа: достаточно измерить люминесценцию клеток панели из 64 штаммов. Это быстрее и дешевле полной протеомики и, что более важно, дает информацию о клеточных процессах, участвующих в ответе на лекарство. Мы можем быстро идентифицировать соединения с новыми механизмами действия, а не просто получать данные о том, «убивает ли вещество грибковую клетку или нет». Метод хорошо работает на модельных дрожжах, и в будущем мы надеемся расширить набор белков для более детальной характеристики механизмов действия отдельных соединений», — говорит Михаил Агафонов, участник проектов, поддержанных грантами РНФ, доктор биологических наук, руководитель группы геномного редактирования промышленных микроорганизмов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН.

В исследовании приняли участие сотрудники Российского университета дружбы народов (Москва), НИИ поиска новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе (Москва) и Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва).