Физики усовершенствовали электронный микроскоп, чтобы биологи могли детально рассмотреть мелкие белки.

Физики долгое время не могли применить фазовый контраст в электронной микроскопии. Оказалось, что нам нужно перестать искать подходящее вещество для фазовой пластинки и обратить внимание на лазеры.

Когда оптические микроскопы стали увеличивать настолько, что можно было увидеть отдельные клетки, исследователи столкнулись с проблемой низкого контраста. Клетки животных и растений в основном прозрачны для видимого света. Маленькие клеточные структуры, ядра и митохондрии, рассеивают небольшое количество света, делая их лишь немного темнее остального содержимого клетки. Этот низкий контраст обычно улучшается за счет предварительного окрашивания биологического материала, хотя это сильно меняет клетку.

Фриц Цернике решил проблему низкого контраста, предложив фазовую пластинку, за что получил Нобелевскую премию. Он понял, что свет, рассеиваясь на клетке, не только теряет яркость (амплитуду), но и замедляется и меняет свою фазу. Фазовый сдвиг невидим для человеческого глаза, но его можно вызвать, сдвинув фазу нерассеянного света на 90 градусов.

Когда рассеянный и нерассеянный свет фокусируется на сетчатке и взаимодействует, световые волны усиливают или подавляют друг друга. Таким образом, детали образца становятся лучше видны, а контраст увеличивается. Чтобы использовать этот эффект, учёный добавил в микроскоп фазовую пластинку. Эта деталь вращает фазу света, проходящего через образец без рассеяния. 

Сейчас биологи используют электронные микроскопы для изучения мелких структур внутри клеток. Это устройство направляет на образец электроны, а не фотоны. Но эта микроскопия также выявила проблему с контрастом. Более того, долгое время не удавалось сделать аналог фазовой пластинки для электронного микроскопа — экспериментаторы, изменяя фазу электронного луча, одновременно слишком сильно уменьшали его интенсивность, делали изображение нестабильным или снижали его разрешение.

Физики из Калифорнийского университета в Беркли (США) нашли способ настолько увеличить контрастность изображений, что мелкие человеческие белки, такие как гемоглобин, становятся отчетливо видны. Для этого потребовалось более 10 лет исследований и мощный лазер с высокой точностью фокусировки. Статья о разработке была опубликована в журнале Science.

Ученые сосредоточились на криоэлектронной микроскопии и криоэлектронной томографии — методах, которые работают при большом увеличении на сильно охлажденном образце. Большинство белков человека и животных без контрастного усиления слишком малы для анализа этими методами.

Чтобы решить проблему, физики добавили вместо пластины лазерное излучение. Они сфокусировали непрерывный лазерный луч в пятно размером несколько микрон и мощностью 75 киловатт. В точке пересечения с электронным пучком лазерное излучение смещает свою фазу на 90 градусов за счет накопленной энергии.

В статье исследователи показали реконструированные изображения фермента альдолазы, который относительно легко визуализировать, и гемоглобина, белка, переносящего кислород в крови, который виден в пределах современных инструментов. Лазерная фазовая пластинка улучшила разрешение структуры белка в обоих случаях, но особенно для более мелкой молекулы — гемоглобина.

Молекулярная масса белка измеряется в дальтонах. Современная криоэлектронная микроскопия с трудом визуализирует белки массой менее 70 килодальтон, а они составляют около 90 процентов всех белков в организме человека. Авторы статьи полагают, что с помощью лазерной фазовой пластинки стало возможным исследовать белки размером до 50 килодальтон, что уже составляет половину белков человека. Они надеются снизить разрешение до размера миоглобина — около 17 килодальтон.

"Это дополнение к криоэлектронной микроскопии потенциально может заполнить огромный пробел в наших знаниях о структурах белков, которые не могут быть кристаллизованы или которые слишком малы для нынешнего уровня техники. А для криоэлектронной томографии это будет революция", - сказал Хольгер Мюллер, профессор физики Калифорнийского университета в Беркли (США), который руководил разработкой.

Исследователи полагают, что такая точность может качественно изменить наше представление о механизмах возникновения и течения заболеваний.